研究背景

小麥是全球范圍內(nèi)消費量最大,廣泛種植的糧食作物之一。然而由于種植品種單一、全球氣候變暖等原因，小麥條銹病、葉銹病、白粉病等葉部真菌病害在我國不同麥區(qū)均有發(fā)生，嚴重威脅我國小麥生產(chǎn)與糧食安全。SAR是植物的一種廣譜防御機制，在初次接觸病原體后被激活。盡管SAR在模式植物如擬南芥中已被廣泛研究，但在小麥和大麥等禾本科作物中的分子機制仍不明確。如何利用植物SAR過程關(guān)鍵基因提升作物抗病水平，是植物免疫學領域從抗病分子機制研究到關(guān)鍵基因開發(fā)利用的重要科學問題。

文獻速遞

2025年5月6日，河北農(nóng)大植物保護學院王逍冬教授團隊在Journal of Advanced Research（IF=11.4）發(fā)表了題為Heterologous expression of the arley-specific HvbZIP87 transcription factor in wheat enhances broad-spectrum disease resistance with balanced yield的研究論文。該研究揭示了大麥轉(zhuǎn)錄因子HvbZIP87在小麥中異源表達可增強廣譜抗病性并平衡產(chǎn)量的分子機制，本文借助DAP-seq技術(shù)系統(tǒng)挖掘了HvbZIP87的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，鑒定出其直接結(jié)合的順式作用元件及調(diào)控的PR基因、鋅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)基因，為小麥抗病高產(chǎn)的分子育種改良提供了重要理論依據(jù)和基因資源。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

本研究通過對大麥轉(zhuǎn)基因系（wNPR1-OE和HvNPR1-Kd）在丁香假單胞菌DC3000觸發(fā)的SAR反應中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因Novel07221（HvbZIP87）在系統(tǒng)獲得抗性（SAR）過程中被誘導表達，且在HvNPR1沉默株系中表達顯著上調(diào)。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，HvbZIP87是大麥特異性基因，在禾本科其他作物中無近緣同源基因，其與小麥、水稻、玉米同源蛋白結(jié)構(gòu)差異顯著。HvbZIP87包含一個核定位信號（NLS，71-77氨基酸）和一個保守的bZIP結(jié)構(gòu)域（pfam07716，67-132氨基酸），亞細胞定位實驗證實其定位于細胞核。NLS 突變后定位至細胞質(zhì)，表明NLS對核定位必需且充分。

圖1. HvbZIP87是參與SAR反應的大麥特異性轉(zhuǎn)錄因子。

為探究HvbZIP87功能，作者構(gòu)建了過表達HvbZIP87的轉(zhuǎn)基因小麥株系HvbZIP87-OE。qRT-PCR檢測顯示，HvbZIP87表達量是內(nèi)源TaActin基因的8-12倍，而野生型中無該基因表達。在誘導SAR反應的相鄰區(qū)域接種稻瘟病菌后，發(fā)現(xiàn)HvbZIP87-OE小麥病斑面積顯著變小。進一步qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，HvbZIP87-OE小麥中致病性相關(guān)的（PR）基因表達水平高于野生型，表明該基因通過激活防御相關(guān)的轉(zhuǎn)錄反應增強抗性。

圖2. 外源表達HvbZIP87可提高小麥的SAR水平。

通過接種多種病原菌觀察抗病表型發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小麥株系對條銹病、葉銹病、斑點枯萎病和鐮刀菌冠腐病均表現(xiàn)出顯著抗性，具體表現(xiàn)為孢子形成減少、病斑面積縮小和壞死程度減輕。農(nóng)藝性狀分析表明，HvbZIP87-OE株高、穗長降低，每穗粒數(shù)減少，但種子更大更重，最終單穗粒重與野生型相當，實現(xiàn)抗病性與產(chǎn)量的平衡。

圖3. HvbZIP87-OE轉(zhuǎn)基因小麥株系的廣譜抗病性。

圖4. HvbZIP87-OE轉(zhuǎn)基因小麥株系的農(nóng)藝性狀。

研究通過HvbZIP87-mCherry與TaNPR1-GFP融合蛋白的共定位實驗發(fā)現(xiàn)，兩者在細胞核內(nèi)共定位，表明兩者可能存在互作。酵母雙雜交實驗證實HvbZIP87與TaNPR1直接互作，互作區(qū)域為TaNPR1的BTB/POZ域（1-170氨基酸）和NPR1/NIM1樣域（355-572氨基酸），且HvbZIP87的bZIP域不參與互作。進一步利用BiFC、LCA和免疫共沉淀實驗，驗證了兩者在植物體內(nèi)的物理結(jié)合，揭示了HvbZIP87與TaNPR1的互作機制。

圖5. HvbZIP87與TaNPR1在細胞核內(nèi)的物理相互作用。

為解析HvbZIP87增強抗性的分子機制，對誘導SAR反應的轉(zhuǎn)基因及野生型小麥進行RNA-seq分析。結(jié)果顯示，HvbZIP87-OE中約2/3的PR基因顯著上調(diào)，表明其可獨立于病原體激活SAR反應。差異基因分析表明，“WT_AR vs WT_CK"與“OE_CK vs WT_CK"共享517個DEGs，GO和KEGG富集顯示其參與多糖結(jié)合、植物-病原體互作、Ca2?信號及ETI通路。植物激素分析發(fā)現(xiàn)，HvbZIP87抑制SA、GA的誘導積累，卻特異性促進ABA積累，并影響IAA、CTK、JA等通路。

圖6. 基于轉(zhuǎn)錄組分析的HvbZIP87調(diào)控網(wǎng)絡。

進一步通過DAP-seq分析，發(fā)現(xiàn)HvbZIP87直接結(jié)合3982個基因，其啟動子區(qū)域存在一個保守的“tgacgtcatcatg"樣順式元件，其中包括TaPR1、TaPR2、TaPR4和TaPR5等PR基因，表明HvbZIP87可直接調(diào)控這些基因表達。GO和KEGG分析顯示，這些基因富顯著集于“鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運"和“C5-支鏈二元酸代謝"通路。結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了103個上調(diào)基因和27個下調(diào)基因。這些差異表達基因再次顯示富集在“鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運"通路，且部分基因與茉莉酸信號通路相關(guān)。研究揭示了HvbZIP87通過直接調(diào)控PR基因、鋅轉(zhuǎn)運相關(guān)基因及多激素通路等多途徑，協(xié)同增強小麥抗病性的分子網(wǎng)絡。

圖7. 小麥中HvbZIP87的調(diào)控順式作用元件及其下游靶標。

研究利用Y2H文庫篩選了72個與HvbZIP87互作的新候選蛋白，其中核定位的TaMYC2在HvbZIP87-OE株系中表達顯著下調(diào)。Y2H和LCA實驗證實HvbZIP87與TaMYC2直接互作，而TaMYC2與TaNPR1無互作。通過VIGS沉默TaMYC2后，小麥對條銹病的抗性顯著增強，表現(xiàn)為孢子形成減少、病斑癥狀減輕，證實TaMYC2是植物防御的負調(diào)控因子。

圖8. HvbZIP87與植物防御調(diào)節(jié)因子TaMYC2的相互作用。

本研究揭示了HvbZIP87調(diào)控小麥防御反應的機制，為提升小麥對多種病害的遺傳抗性提供了新途徑。

圖9. HvbZIP87調(diào)控小麥防御反應的分子機制。